显微镜实验-四氧化锇OsO4染色步骤

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显微镜实验-四氧化锇OsO4染色步骤

所属分类：显微镜百科点击次数：2690 发布日期：2019-05-11

四氧化锇OsO4 是最常用的染色剂，通常使用锇蒸汽或者2%的溶液。有些特定样品需要跟酰肼，氯磺酸等同时使用，并且使用OsO4 作后染色。有些样品使用四氧化钌RuO4进行染色会获得更好的结果，并且更加简单方便，节省时间。

Polymer Microscopy 这本书的4.4.2节有四氧化锇染色方法的详细综述。

超薄切片之前进行块染比超薄切片后染色效果更好。

OsO4染色步骤

通常有两种染色方法：

一，2% OsO4 溶液60°C染色数小时
二，利用OsO4 固体结晶释放锇蒸汽，在常温（25°C）熏染数小时
首先在体式镜下对样品进行修块，然后把样品块放进一个特制的染色容器内，通常是一个干燥器（根据G.Owen & D. Vesely的描述，详见Proceedings of the Royal Microscopical Society , Nov-85）。容器内放置一枚打开的含有OsO4 结晶的安瓿瓶，整个容器放置在通风橱内室温（25°C）染色过夜。染色完毕后，样品用水冲洗至少1小时，干燥后切片。样品需放置在通风橱内，因为样品依然含有OsO4 (0.2 ug/kg)。

一个简易的替代方法是，打破一个含有饿酸晶体的安瓿瓶，把它同样品一起放在培养皿里，盖上盖子后放在干燥器里面，取出干燥器里面的硅胶，加入一定量的1M NaHSO3溶液。整个干燥器放在通风橱里染色过夜，一般染色16小时左右会获得比较理想的结果。

如果没有饿酸晶体，只有2%的饿酸溶液，染色方法如下：把样品块用双面胶粘在一个10 ml 的玻璃小瓶上部，加入2% 的饿酸溶液，盖上盖子，放在干燥器里，取出干燥器里面的硅胶，加入一定量的1M NaHSO3溶液，整个干燥器放在通风橱里染色过夜。（注意：使用溶液会非常脏，所有东西都会被沾上有毒的饿酸）

注：

一定要在通风橱内工作。
一定要戴一次性手套。
一定要避免吸入锇蒸汽，一旦闻到味道了，就已经吸入了有毒气体。
一定要放在干燥器里进行染色，干燥器里加入1M NaHSO3可以吸收掉锇蒸汽。
一定要将染好的样品依旧放在通风橱内，只在切片的时候拿出来。

上述列表并不完全，并且常温切片和低温冷冻切片只是为了做一个区分，最终方法的选择还是取决于材料的软硬程度。

OsO4染色后再进行RuO4后染色

1、超薄切片后染色：

很多材料仅仅使用OsO4染色是不够的，还需要在超薄切片后进行RuO4熏蒸染色，以便获得更好的结构，定位各种不同的组分。超薄切片后染色需要数秒钟到15-30分钟不等，这取决于材料的特性。通常先获得几张切片，然后做一个染色时间的梯度，以便得到最适染色时长，这比用一直重复染一张切片来的容易。

切记，使用碳支持膜或者无膜的铜网，不要使用Formvar膜铜网，Formvar膜本身会被染色。

2、块染：

如果需要进行块染，方法见RuO4染色法。饿酸染色之后RuO4块染的方法，是针对具有“半结晶相”结构的材料（polyethylene, polypropylene,EPR-rubber, EPDM-rubber, Nylon,polymethylpentene etc.）的一种方法，这样可以显示半结晶结构和定位不同的相。

聚合物OsO4染色法参考文献：（文章1实际上是后面所有文章的基础，只是不同样品选用了不同参数而已）
1) Osmium tetraoxide fixation of rubber latices. Kato, K. Polymer Letters 4, 35-38 (1966).
2) Elektronenmikroskopie an kunststoffen am beispiel des polyäthylens. Kanig, G.Kunststoffe, Bd. 64, 470-474 (1974)
3) Further electron microscope observations on polyethylene I. Granule structure of the melt as an artifact. Kanig, G.Colloid & Polymer Sci. 265, 855-859 (1987).
4) The chemistry of Osmium tetraoxide fixation. Behrman, E. J.Science of Biological Specimen Preparation (1-5).
5) The role of sample preparation on the study of the microstructure of rubber-reinforced polymers. Castaño, V. M., Oliva, E., Del-Real,A., Mexia, P., Viquez, S, Rivera, E, and Martinez, E. Polymer Bulletin 32, 693-696 (1994).
6) Transmission electron microscopy of saturated rubber modified polymer systems. Kakugo, M., Sadatoshi, H., Yokoyama, M. Journal of Polymer Sci.: Part C: Polymer Letters, 24, 171-175 (1986).
7) New staining technique for distinction between crystalline and amorphous parts in transmission electron microscopy of
poly(tetrahydrofuran).Ishikawa, S., Ishizu, K., and Fukutomi, T.
8) A novel staining technique for studying toughning mechanisms in saturated acrylic rubber modified polymers. Sue, H.J., Garcia-Meitin, E. I., Burton, B. L., and Garrison, C. C. Journal of Polymer Sci.: Part B: Polymer Physics, 29, 1623-1631 (1991).
9) Ein neues Kontrastierverfahren für die elektronenmikroskopische Untersuchung van säure- und estergruppenhaltigen
Polymersystemen. Kanig, G., and Neff, H. Colloid & Polymer Sci. 253, 29-31 (1975).
10)Ein neues Kontrastierungsverfahren für die elektronenmikroskopische Untersuchung der Morphologie von Polyamiden. Weber, G., Kuntze, D., and Stix., W. Colloid & Polymer Sci. 260, 956-958, (1982).

聚合物样品RuO4染色法

四氧化钌RuO4染色方法，详见参考文献1-11，最常引用的文献是1-5，文章1和5是最重要的。文章1揭示了RuO4与大多数已知聚合物的反应原理，这在处理聚合物混合样品时非常重要。文章5是篇阐述用RuCl3和 NaOCl产栺RuO4蒸汽进行染色的文章，这个方法比直接使用RuO4溶液染色要好得多，因为RuO4蒸汽是现制的。

Polymer Microscopy 这本书的4.4.6节有四氧化钌RuO4染色方法的详细综述。

超薄切片之前进行块染比超薄切片后染色效果更好。

RuO4块染染色步骤

反应方程式：2RuCl3 · 3H2O + 8NaClO → 2RuO4 + 8NaCl + 3Cl2+ 3H2O

方法：0.2 g RuCl3加 10 ml 5% NaClO溶液，成为工作液。

先用双面胶把样品块粘在一个10mL的玻璃小瓶上部，放入少量RuCl3在瓶子底部，用枪加入双倍的NaClO，盖上盖子，反应会立即开始。将玻璃小瓶放在干燥器里，更好在加NaClO溶液之前就放在干燥器里。干燥器底部放有一定量的1M NaHSO3溶液，用以吸收多余的RuO4蒸汽。染色完毕后，样品用水冲洗至少1小时，干燥后切片。

染色过程的所有工作应在通风橱内完成，毒性残留量未知，把它当作和OsO4一样有毒，样品有毒物质残留0.2 ug/kg(0.2 ppb)。

染色容器如下图所示：

应用实例：