冷发光原理与特点：

一些非常常见的生物或生化实验方法均基于若干种““过程”或“变化”（…escence）”的存在，如发磷光（phosphorescence）、化学发光（chemiluminescence）、生物体发光（bioluminescence）和发荧光（fluorescence）。本文以荧光蛋白为主题，了解更多““过程”或“变化”（…escence）”可能大有裨益。这些现象源于拉丁语“看见（-escentia）”，这本身已经暗示与我们的视觉系统具有相关性。所有的““过程”或“变化”（…escence）”都表示我们用眼睛可以感知的物理、化学或生物过程。我们在表示变化、活动或过程的单词（如convalescence，康复）后面添加后缀““过程”或“变化”（…escence）”。

所以，很显然，荧光是一种我们看得见的、涉及某种变化或某个过程的东西。后面我们再来学习荧光如何满足这些条件。我们首先浏览一下其他的““过程”或“变化”（…escence）”，这些都涉及到冷发光。冷发光是非高温条件下发光现象的统称。因此，冷发光可以确定为一种冷体辐射现象。这种辐射可以是化学反应的一部分，也可以是晶体上产生亚原子运动或应力的原因。另一种发光的方式是遇热发光，这里的光由受热物质（如热金属）发出。

化学发光是基于化学反应的发光过程，其中产物具有激发中间体。这种中间体回落到基态时发光。与荧光不同，化学发光材料中的电子由化学反应而不是光子能量吸收激发。化学发光可应用于发光棒等。众所周知的化学发光物质是发光氨，它在刑事侦查中用来发现血迹。这里，血红蛋白中的Fe2+离子将发光氨催化至其发光结构。

如果活生物体发光，不管这种光如何产生，我们都称之为生物体发光。发光的生物体种类众多，如萤火虫（Lampyris noctiluca）或萤火虫（Photinus pyralis）。真菌中有一种非常特别的生物体，名叫奥尔类脐菇（Omphalotus nidiformis），它在黑暗中发光。许多海洋生物，比如珊瑚、海藻、甲壳纲甚至乌贼都发光，它们发出的光大多数为蓝光或绿光。另一种海洋生物是发光水母（Aequorea victoria），绿色荧光蛋白（GFP）的来源。萤火虫等发光只涉及化学发光过程，而A. victoria则涉及化学发光和发荧光过程。科学家发现，水母借助发光蛋白质通过化学反应产生蓝光。然后，这种蓝光在荧光反应中被用来激发前述GFP，从而产生绿光。

图1：荧光雅布伦斯基图

这将我们带到“荧光是什么？”这个问题。发荧光是物质吸收较短波长的光后发光的过程。波长差异称为斯托克斯位移。详细一点说明，如果物质以光子形式吸收光，将产生荧光。这导致电子转移到较高的能级。但是，这种高能量状态非常不稳定，这就是电子往往会返回到基态的原因所在。在此过程中，能量以光子的形式再次释放，并因此发光。与磷光相较，电子能量转移非常快，实际上以纳秒为单位（见图1）。以一个波长激发后发射不同波长的光的任何物质，称为荧光物。这些在下一节中讨论。自然界的大多数荧光物具有宽阔的激发和发射光谱，但对于荧光显微技术，激发和发射更大值明确的物质更有用。

与发荧光类似，发磷光是磷光材料受光激发后发光的现象。尽管它与荧光密切相关，但它的过程要慢得多。相较于荧光，光子的重新发射因激发电子能与“禁止”状态的相关性而减速。因其能量“被捕捉”，它们返回到基态的速度没有荧光那么快。典型的发磷光材料是“在黑暗中发光”的玩具，它们可以用普通灯泡或日光“充电”，便可数分钟甚至数小时发光。

荧光物特征

荧光团里面是发色团，这是分子中确定颜色的部分（见图2）。在发色团中，发生电子能级转换和相互关联的光发射（见上文）。至少有两种发色团。它们要么由共轭的π电子共振系统构成（GFP），要么由金属络合物构成（叶绿素、亚铁血红素）。

因其与显微技术具有相关性，我们将进一步了解GFP的发色团。研究发现，GFP发色团的形成除了需要分子氧，无需其他辅助因子或酶组分。受限于GFP氨基酸主链的一级结构，它通过自催化折叠机制自发形成，并通过分子内重排完成。细看可以发现，发色团由三个相关的氨基酸构成。Ser65、Tyr66和Gly67依次经历环化、脱水和氧化。这些反应的结果是生成共轭的π电子共振系统，即成熟的GFP发色团。

图2：荧光蛋白的层次结构

观察整个GFP结构，可见环状三肽位于圆柱中间。这个圆柱包含11条链，构成一个β-桶状结构，使蛋白质高度稳定。β-桶状结构直径约为3 nm，高度约4 nm（见图3）。所有迄今为止已知的FP都具有这种保护圆柱，这对它们的光物理性质产生很大影响。GFP的量子产率和光稳定性较高。此外，蛋白结构非常紧凑，耐酸碱效果好。带有GFP标签的样品温度稳定性较高，而且耐多聚甲醛、尿素或盐酸胍等变性物质的能力强。

 图3：绿色荧光蛋白（GFP）的分子结构

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