接上：荧光显微镜冷发光现象的原理与特征(上）

一、淬灭和漂白
不过，荧光蛋白也有一定的局限和限制，这在下一节中提及。比如，淬灭过程使荧光团强度可逆地降低。这种衰变的原因有多种。一方面，可能形成复合物或发生了内部转换。另一方面，淬灭可能是能量转移的结果。FRET利用了这个过程。在荧光共振能量转移过程中，供体荧光团D的能量转移到受体荧光团A。D的荧光减弱，而A的荧光则增强。

相较于淬灭这种可逆过程，另一种荧光衰减过程，称为漂白，则是不可逆的。如果荧光基团长时间暴露于激发光下，荧光团会遭到破坏，荧光损失将不可逆转。漂白程度取决于光源的强度、暴露时间和能量。每个荧光团都有特定数量的激发和发射周期，直至淬灭。GFP的每个分子可以激发约104–105次。这相当于0.1–1秒。

使用激光扫描共聚焦显微镜时，常用的光强一般为大约106 W/m2。这种高能量导致大量荧光分子处于激发态中。在这种情况下，它们不再在平常的激发波段吸收光。这样一来，有效的染料浓度减小，换言之，屏幕上一个像素的强度不再是染料浓度的直接函数。与弧光灯照明相比较，使用高能量激光时发射和激发之间呈非线性关系。
 
二、量子产率
谈到荧光蛋白的效率，我们应提到量子产率。这是荧光团的另一个特征，它比较光子输入和输出。计算特定荧光团的量子产率时，以发射光子量除以吸收光子量：

通过这样计算，可以比较不同荧光蛋白的亮度。以摩尔消光系数为56,000 M–1cm–1、量子产率为0.6的EGFP为例，获得的值为33.6 M–1cm–1。有时候，人们用到荧光蛋白的相对亮度。在这种情况下，亮度的计算方式为摩尔消光系数乘以量子产率再除以EGFP的亮度值（33.6 M–1cm–1）。这样做，相对亮度被转换为众所周知的EGFP，可更加快速地比较不同的荧光蛋白。

三、光稳定度
许多荧光显微镜实验涉及到活细胞的观察。考虑到淬灭和漂白等特征时，发现活细胞成像质量非常依赖于成像时间。即便是组织学或固定细胞样品，也要注意照射样品的时间不要太长，光强不要太高，这点很重要。描述荧光蛋白抵抗荧光状态衰减机制的参数是光稳定性。光稳定性以截至50%初始亮度消失所消耗的秒数表示。为了比较，以更高值为10 W/cm2的弧光灯提供照明，因为激光等高强度光源（高达100 W/cm2）可能产生非线性效果。此外，为了测量和比较光稳定性，荧光蛋白样品的标准pH应为7.0，并调节蛋白溶液微滴大小，使其与一般的哺乳动物细胞等大。采用上述光源连续照明，同时计算光子的发射量。EGFP的一半初始亮度消失耗时174秒（Shaner等 2005）。换言之，发射量从1,000光子/秒降至500光子/秒耗时174秒。

 
了解了特定荧光染料或蛋白质的激发和发射更大值、亮度、量子产率等不同特征，实验人员就可以选择不同的染料以及观察条件来满足特定实验的要求。此外，如果他知道不同荧光染料或蛋白的光谱物理特征，他可以详细地阐述结果。

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